摘要：在这项工作中，设计用于静脉安培葡萄糖传感器的一氧化氮 (NO) 释放涂层通过使用掺杂有亲脂性二氮烯二醇化物质的聚乳酸 (PLA) 层进行优化，该物质通过质子驱动机制释放 NO。Elast-Eon E2As 聚氨酯涂层用于缓和传感器表面的 NO 释放并增加传感器对葡萄糖的线性检测范围。通过植入兔静脉，对这些传感器的抗血栓性和体内葡萄糖性能进行了评估。通过将 NO 通量保持在与内源性内皮细胞相似的水平，植入的葡萄糖传感器表现出减少的表面凝块形成，从而能够连续进行更准确的定量葡萄糖测量。植入静脉传感器的体内时间轨迹表明，葡萄糖值与基于台式床旁即时传感器的仪器的血液样本离散测量值密切相关。通过使用单点体内校准和在牛血清溶液中体外获得的校准曲线，将来自植入式葡萄糖传感器的 7 小时时间段内的原始测量电流转换为葡萄糖浓度。在没有释放功能的情况下组装的控制传感器在 7 小时的体内植入期间表现出独特的表面凝血。
一、简介
血糖的准确监测和控制在糖尿病患者的治疗中起着关键作用。台式床旁护理设备是许多医院和医疗保健机构的当前标准，手指采血血糖仪广泛用于个人和家庭血糖测量。虽然这些设备产生离散的血糖值，但当使用此类设备时，葡萄糖浓度迅速增加/减少的趋势通常不会被观察到。一些市售设备使用植入的电化学传感器提供间质液的连续葡萄糖监测。然而，由于血糖浓度变化和间质液葡萄糖变化之间存在约 10-15 分钟的滞后时间，在实践中，这些设备只能补充而不是完全替代离散血液测量。
静脉电流葡萄糖传感器可以为连续血糖测量提供更好的替代平台，尤其是在医院环境中。事实上，严格的血糖控制是重症监护病房 (ICU) 中许多患者的一项要求，以实现有针对性的治疗和更好的患者治疗效果。这项工作中描述的电流葡萄糖传感器旨在通过现有的 IV 端口接入或插入导管中植入重症监护患者的静脉内。这种连续测量将使医务人员能够看到血糖上升和下降的趋势，从而使他们能够选择更好的治疗方案。文献中曾报道过小型化电化学血糖传感器；然而，当将这些传感器放置在住院患者的血流中时，由于其表面形成血栓，这些传感器会很快失去分析准确性。通过与封装的血小板形成血栓，传感器表面附近的局部葡萄糖浓度可以通过血小板和其他被困细胞的代谢活动降低，因此，与血液血浆相内的葡萄糖水平相比，传感器读取的葡萄糖值是错误的。一氧化氮众所周知的抗血栓形成和抗炎特性提供了一种潜在地增强血液接触表面的血液相容性的有用方法。将释放 NO 的供体分子结合到传感器的外部聚合物涂层中，使其能够模拟排列在所有血管内壁上的内皮细胞的功能，以 (0.5-4.0)×10^(-10) mol cm^(-2) min^(-1) 的局部通量内源性释放 NO。这种方法先前已被证明可以减少静脉内葡萄糖传感器表面的凝块形成并保持其体内性能。在此，我们通过进一步优化 NO 释放配方和用于制备此类装置的外部葡萄糖限制层来扩展这项早期工作，以实现更佳的线性和体内性能。
二、实验
葡萄糖氧化酶（VII 型，来自黑曲霉）、D-(+)- 葡萄糖、戊二醛 (25%)、牛血清白蛋白 (BSA)、牛血清（除菌过滤）、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠七水合物 ,磷酸二氢钾二水合物,氯化铁 (III) (FeCl3),37% 盐酸 (HCl),L-抗坏血酸,尿酸,Nafion（5 wt% 低级脂肪醇/H2O 混合物溶液）,间苯二胺 、间苯二酚和四氢呋喃 (THF) 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。酯封端聚乳酸材料 (PLA,100 DL 7E) 购自 Evonik（前身为 Lakeshore Biomaterials, Birmingham, AL）。E2As Elast-Eon 热塑性聚氨酯是（可通过富临塑胶购买）。如前所述，通过用购自低温气体（底特律，密歇根州）的 80 psi NO 气体在室温下处理 DBHD 24 小时，合成二氮烯鎓二醇化的 N,N0-二丁基 L^(-1)，己二胺 (DBHD) 或 DBHD/N2O2。所有电流测量值均使用通道 ESA BioStat 恒电位仪进行收集。
葡萄糖传感器是根据以前的设计构造的，首先在铂/铱线（外径 = 0.2 毫米）的聚四氟乙烯涂层中切割一个 1 毫米长的空腔。在空腔上涂上Nafion涂层，然后通过CV电聚合工艺（循环电压在0到+830 mVat 2mV s^(-1) 18 h）将一层聚合间苯二酚和间苯二胺应用于空腔，以帮助阻止电活性干扰物质，如抗坏血酸、尿酸和对乙酰氨基酚到达 Pt/Ir 表面。银/氯化银 (Ag/AgCl) 线电极紧紧缠绕在传感器周围作为电化学参考，并使用热缩聚酯管将参考线固定到位（图 1a）。然后使用戊二醛将葡萄糖氧化酶固定在空腔内。然后使用线环将外层施加到传感器的表面：首先，施加含有二氮烯鎓二醇化二丁基己基二胺（2：1，wt / wt）（图1c）的酯封聚乳酸层以赋予传感器NO释放行为，然后是 2% (wt/vol) Elast-Eon E2As 聚氨酯的四氢呋喃溶液（图 1b）用作面漆以调节 NO 释放，并通过限制葡萄糖扩散到酶层中来控制传感器对葡萄糖的线性检测范围。E2As 聚氨酯以前曾作为 NO 释放涂层使用并取得了积极的成功，以防止体外循环兔模型中的血小板活化和凝血。完全组装的传感器的示意图如图 1a 所示。控制传感器是通过类似的程序制备的，除了在 PLA 涂层中没有掺杂二氮烯鎓二醇化的二丁基己基二胺。
图 1. (a) 针/导管式葡萄糖传感器设计；(b) E2As Elast-Eon聚氨酯用于传感器外层；(c) 亲脂性二氮烯鎓二醇化二丁基己基二胺和一氧化氮释放的质子驱动机制。
三、结果与讨论
这些传感器在生理条件下 (pH 7.4,37.5 ℃) 浸泡在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 或牛血清中，以水合聚氨酯层以限制葡萄糖扩散，并激活 PLA 层内的质子释放 NO。PLA 通过在缓慢水解时提供质子来控制 NO 释放层的局部 pH 值。理想情况下，传感器会在内皮细胞 ((0.5-4.0) T 10^(-10) mol cm^(-2) min^(-1)) 的生理水平上以稳定的通量释放 NO，持续时间为传感器的功能持续时间 寿命。使用 Sievers 一氧化氮分析仪 (NOA) 300i 通过化学发光测量传感器表面释放的一氧化氮。用于体内实验的优化传感器在 7 天内的 NO 释放曲线如图 2a 所示。在此期间，传感器在牛血清溶液（含有生理水平的葡萄糖）中保持 NO 释放高于 0.5×10^(-10) mol cm^(-2) min^(-1)。没有释放曲线会出现初始爆发，然后是急剧的每日衰减。如图 1c 所示，二氮烯鎓二醇化二丁基己基二胺的 NO 释放机制取决于质子的稳定供应。在我们之前发表的体内葡萄糖传感器实验中，使用 50:50 酸封端聚（乳酸-乙醇酸共聚物）(PLGA) 来配制 NO 释放层以控制传感器表面的局部 pH 值。这种材料的固有酸端聚合物链与共聚物结构相结合，产生相对较快的水解速率；因此，基于 PLGA 的 NO 释放曲线以第 1 天的大量 NO 爆发开始，随后几天出现特征性衰减。相比之下，本文报道的研究中使用的 PLA 具有酯封端基，这会减慢水解速度，因此在测试期间提供更稳定的 NO 释放曲线。这确保 NO 释放将保持大于 0.5 T 10^(-10) mol cm^(-2) min^(-1)，直到传感器使用寿命的第 7 天之后。
图 2. (a) 传感器在第 1 天测试前 37.5 ℃ 牛血清中储存 3 天，以及植入体内后第 7 天测量的一氧化氮释放通量；(b) 体内植入前代表性传感器在 37.5 ℃ PBS 和牛血清中的校准曲线。
E2As Elast-Eon，一种由聚（二甲基硅氧烷）和聚（六亚甲基氧化物）的混合软链段与亚甲基二苯基异氰酸酯（MDI）硬链段组成的聚合物，被用作葡萄糖传感器制造中的最外层涂层，因为据报道它表现出优异的内在生物相容性和生物稳定性，具有低水平的血液蛋白粘附。由于顶层涂层固有的血液相容性应增强 NO 释放装置的整体抗血栓特性，因此选择 E2As 替代我们之前体内葡萄糖传感器设计中使用的 PurSil 热塑性硅酮聚醚。在台式研究中，E2As 涂层传感器显示出对线性葡萄糖检测范围的理想控制（减缓葡萄糖扩散到酶层，因此传感器不受氧气水平的限制）；通过这一层的 NO 释放对于这项体内研究也是完全可以接受的。NO 释放传感器的安培葡萄糖响应的线性范围也在体内植入前后的两种类型的溶液（PBS 和牛血清）中进行了体外测量，以评估其性能和恢复情况。理想情况下，传感器不仅应在 4.4-6.6 mmol L^(-1) 的标准静息血糖范围内具有线性响应，但它还应提供低血糖和高血糖范围内的准确测量值 (1.0-20.0 mmol L^(-1))。该传感器还应该对血液中存在的其他电活性物质具有选择性，这些物质会在传感器的 +600 mV（相对于 Ag/AgCl）工作电位下干扰过氧化氢的电化学氧化。在 PBS 和牛血清中体外测试的代表性传感器的葡萄糖校准曲线（图 2b）表明传感器在两种环境中具有相似的线性范围，尽管在血清中观察到更高的校准截距和降低的灵敏度，这可能是由于该商业血清基质中存在额外的未知干扰物质所致。用于连续监测的传感器的响应时间也应尽可能短，以便它们能够对快速的血糖浓度变化做出快速反应。因此，图 2b 所示的体外血清校准实验中使用的传感器的典型响应时间为 5 分钟（响应时间定义为信号在葡萄糖浓度变化后达到其最终稳态电流值的 95% 所需的时间）。
当植入兔颈静脉时，葡萄糖传感器用于测量体内血糖水平并生成电流计时间轨迹（图 3a）。当静脉注射一团 50% 的葡萄糖溶液来调节兔子的静脉葡萄糖浓度时，NO 释放传感器响应由此产生的血糖变化，阳极电流成比例增加。此外，如图 3b 所示，在体内实验 7 小时后，释放 NO 的传感器在其表面没有形成明显的凝块；因此，传感器的表面将直接与血液接触，观察到的电流将与真实血糖值保持正比。相比之下，没有释放 NO 的控制传感器迅速形成表面凝块，如图 3b 所示。对照和 NO 释放传感器的凝血模式之间的对比与之前通过兔子研究在体内评估的葡萄糖传感器获得的结果非常相似。因此，这种行为代表了预期的凝血现象，当通过许多未来的体内动物研究测试具有优化外层的附加传感器时将观察到这种情况。凝块内的细胞（例如，血小板）在局部传感区域消耗葡萄糖，这也会产生额外的扩散屏障，导致放置在体内时控制传感器的电流非常低。需要注意的是，由于麻醉，兔子的血糖水平开始处于高血糖水平 (13.8 mmol L^(-1))，然后随时间下降，直到输注葡萄糖。
图 3. (a) 体内植入传感器的原始电流时间轨迹。给予2次50%葡萄糖注射液调节家兔血糖；(b) 体内实验后对照（顶部）和 NO 释放（底部）葡萄糖传感器的照片。虚线左侧的传感器部分实际上位于静脉内。
为了评估葡萄糖校准的准确性，将 ALB-800 Flex Radiometer 血气分析仪采集的离散静脉血糖值与传感器提供的连续测量值进行比较。基于 1 小时时间点的静脉血糖的单点校准和牛血清中 NO 释放传感器的体外校准均用于将原始电流值转换为相应的葡萄糖浓度。在图 4 中，将离散静脉血糖值与连续葡萄糖测量值进行比较，通过单点校准和 NO 释放传感器的体外牛血清校准以及控制传感器的单点校准进行转换。当静脉注射 50% 的葡萄糖时，NO 释放传感器会快速响应，并且校准的葡萄糖值与血气分析仪的值比控制传感器的值更接近。对葡萄糖推注的响应时间延迟和控制传感器对静脉血糖浓度的偏差可能是由于大量表面凝块形成（图 3b）。
图 4. 台式血气分析仪测得的葡萄糖浓度值与连续传感器测得的换算电流值的比较。使用牛血清中的校准曲线将电流转换为葡萄糖浓度（mmol L^（-1））（图 2）；另一个转换是在 1 小时时间点进行的单点校准。
因此，一氧化氮的释放为传感器提供了抗体内血栓形成的能力，使传感器能够在其植入期间保持连续的分析功能和测量准确性。当用于转换从 NO 释放传感器获得的原始电流值时，单点血气校准和牛血清校准都产生相似的值。
四、结语
总之，E2As Elast-Eon 作为外涂层和酯封端 PLA 作为含有 NO 释放二氮烯鎓类物质的层的新型结合似乎提供了一种理想的组合涂层，以创建改进的血管内电化学葡萄糖传感器。E2As 材料的使用发挥了关键作用，它通过限制葡萄糖扩散到葡萄糖氧化酶层来维持对高达 20 mmol L^（-1）的静脉血糖浓度的线性响应。PLA 用于在含有二氮烯二醇化 DBHD 的层内维持局部酸性环境，从而延长 NO 的释放。由此产生的 NO 释放曲线足以让连续监测电化学葡萄糖传感器模拟内皮细胞的行为，使它们能够抵抗表面凝块形成。这种抗血栓性对于保持体内分析性能和功能是不可或缺的。释放 NO 的葡萄糖传感器的准确性通过植入兔静脉内进行评估。用葡萄糖推注调节动物的静脉血糖可用于帮助确定葡萄糖传感器的响应时间。控制传感器会迅速形成表面凝块，从而增加响应时间并降低其测量精度。NO 释放功能有助于防止表面凝块形成，从而在将结果与从动物身上抽取的离散血液样本获得的全血分析仪值进行比较时，保持快速传感器响应时间和葡萄糖浓度测量精度。在这项初步研究中，优化用于制造这些装置的 NO 释放配方和外部葡萄糖限制层已经提高了体内性能。对于未来的体内实验，预计使用这种新颖设计的附加传感器将观察到抗血栓性和改进的分析测量精度。
编辑|富临塑胶
富临塑胶供应E2As Elast-Eon长期植入聚碳酸酯基含硅聚氨酯，
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